|
การโคลนการแสดงออกการทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 ใน Escherichia coli |
|---|---|
| รหัสดีโอไอ | |
| Title | การโคลนการแสดงออกการทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 ใน Escherichia coli |
| Creator | สุภาภรณ์ วะน้ำค้าง |
| Contributor | วันชัย อัศวลาภสกุล |
| Publisher | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Publication Year | 2559 |
| Keyword | ฟรักโทส, อินูลิน, Fructose, Inulin |
| Abstract | เนื่องจากความหลากหลายในการประยุกต์การใช้งานจากฟรุกโทสและฟรุกโตโอลิโกแซกคาไรด์ เป็นสารที่มีประโยชน์และเป็นที่ต้องการในทางอุตสาหกรรมอาหาร และทางการแพทย์ จึงมีความต้องการในการผลิตสารดังกล่าวเป็นปริมาณมาก ในกระบวนการผลิตฟรุกโทสจะใช้โพลิแซคคาไรด์จำพวกแป้งเป็นสารตั้งต้นในกระบวนการผลิตและฟรุกโทสที่ได้มีความบริสุทธิ์ที่ต่ำ ปัจจุบันกระบวนการผลิตฟรุกโทสและฟรุกโตโอลิโกแซกคาไรด์ให้ได้พร้อมกัน โดยใช้เอนโดอินูลิเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่พบได้ในจุลินทรีย์บางชนิด อาทิเช่น Arthrobacter sp., Aspergillus sp. และ Penicillium sp. เป็นต้น ดังนั้นในงานวิจัยนี้ได้ทำการโคลนยีนประมวลรหัสอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 เพื่อที่จะผลิตอินูลิเนสให้ได้จำนวนมาก และด้วยเหตุว่าลำดับเบสของอินูลิเนสยังไม่ถูกค้นพบ จึงได้ออกแบบ degenerated primers จากแบคทีเรียที่ผลิตเอนโดอินูลิเนสได้แล้วทำการเพิ่มจำนวนยีนโดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส เพื่อให้ได้ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนประมวลรหัสอินูลิเนสของ Streptomyces sp. CP01 หลังจากนั้นจึงนำลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนไปทำการเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ผ่านทางคอมพิวเตอร์ (BLAST, ฐานข้อมูล NCBI) พบว่ามีความคล้ายคลึงกับเอนโดอินูลิเนสของ Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 จากนั้นจึงได้ทำการออกแบบไพร์เมอร์จำเพาะเพื่อโคลนยีนประมวลรหัสอินูลิเนสของ Streptomyces sp.CP01 พบว่ายีนประมวลรหัสอินูลิเนสมีความยาว 2,892 นิวคลีโอไทด์ แปลรหัสเป็นกรดอะมิโนได้ 963 กรดอะมิโน จากนั้นจึงนำยีนดังกล่าวเชื่อมกับเวกเตอร์ pET28a (+) และถ่ายโอนเข้าสู่ Escherichia coli สายพันธุ์ Rosetta-gami (DE3)pLys S และ BL21(DE3) เพื่อเหนี่ยวนำการแสดงออกด้วย 0.1mM IPTG ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เพื่อตรวจสอบการแสดงออกด้วย SDS-PAGE และ Western blotting analysis พบโปรตีนที่ขนาดประมาณ 107 กิโลดาลตัน ละลายอยู่ในส่วนน้ำใสบางส่วน และมีกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนส พบว่าอินูลิเนสที่ได้จากรีคอมบิแนนท์โคลน Rosetta-pET28a-SA34 มีกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนสสูงที่สุด จึงนำโปรตีนรีคอมบิแนนท์อินูลิเนสจากโคลนดังกล่าวมาทำให้บริสุทธิ์ด้วย Affinity Column Chromatography และนำมาทดสอบสมบัติของเอนไซม์ พบว่าสภาวะเหมาะสมในการทำปฏิกิริยาของรีคอมบิแนนท์อินูลิเนส คือสภาวะอุณหภูมิที่ 40 o C pH 7 และความเข้มข้นอินูลินที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยา คือ 20 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร เมื่อศึกษาค่าทางจลนพลศาสตร์ของรีคอมบิแนนท์อินูลิเนส พบว่าค่าคงที่ของ Michaelis-Menten (Km) เท่ากับ 11 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และความเร็วสูงสุดของเอนไซม์ (Vmax) เท่ากับ 0.088 มิลลิกรัม/นาที/มิลลิลิตร และเมื่อนำรีคอมบิแนนท์อินูลิเนสมาทดสอบการย่อยเพื่อหาผลิตภัณฑ์ที่เอนไซม์ย่อยได้ด้วยวิธี Thin Layer Chromatography พบว่ารีคอมบิแนนท์อินูลิเนสสามารถย่อยอินูลินได้เป็นซูโครสและฟรุกโตโอลิโกแซกคาไรด์บางส่วน |
| URL Website | cuir.car.chula.ac.th |
