|
Mutagenesis of amylomaltase from corynebacterium glutamicum ATCC 13032 to improve thermostability of the enzyme |
|---|---|
| รหัสดีโอไอ | |
| Title | Mutagenesis of amylomaltase from corynebacterium glutamicum ATCC 13032 to improve thermostability of the enzyme |
| Creator | Pitchanan Nimpiboon |
| Contributor | Piamsook Pongsawasdi, Jarunee Kaulpiboon |
| Publisher | Chulalongkorn University |
| Publication Year | 2558 |
| Keyword | Mutagenesis, Cyclodextrins, Corynebacterium glutamicum, ฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์, ไซโคลเดกซตริน |
| Abstract | งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อปรับปรุงการทนความร้อนของเอนไซม์แอมิโลมอลเทสจาก Corynebacterium glutamicum ด้วยวิธีการกลายยีนแบบสุ่ม และการกลายยีนแบบเฉพาะตำแหน่ง จากผลการกลายยีนแบบสุ่มด้วยเทคนิค error-prone PCR พบว่าสามารถคัดเลือกเอนไซม์แอมิโลมอลเทสกลายที่ทนอุณหภูมิ 50 ºซ ได้ 1 โคลนในขณะที่เอนไซม์ดั้งเดิมสูญเสียแอกทิวิตีเกือบทั้งหมด ตรวจสอบพบว่าเอนไซม์กลายมีกรดอะมิโนกลายจากเอนไซม์ดั้งเดิม 1 ตำแหน่งคือ A406V เพื่อตรวจสอบว่าตำแหน่ง Ala406 มีผลต่อการทนความร้อนของเอนไซม์ จึงใช้เทคนิคการกลายยีนแบบเฉพาะตำแหน่งในการกลายยีนให้เป็น A406V และ A406L เมื่อนำเอนไซม์กลายทั้ง 2 ชนิดไปตรวจสอบลักษณะสมบัติพบว่า เอนไซม์กลาย A406V และA406L เร่งปฏิกิริยา transglucosylation ได้สูงขึ้นจากเอนไซม์ดั้งเดิม มีอุณหภูมิ และ pH ที่เหมาะสม สำหรับปฏิกิริยา disproportionation และ cyclization เพิ่มขึ้นจากเอนไซม์ดั้งเดิม และ สามารถทนอุณหภูมิที่ 35 ºซ และ 40 ºซ ได้ดีกว่า นอกจากนี้ผลของการทำ DSC พบว่าเอนไซม์กลายทั้ง 2 ชนิดมีรูปแบบการคงทนต่อความร้อนที่อุณหภูมิสูงขึ้นกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม โดยที่เอนไซม์ A406V แสดงผลของการเร่งปฎิกิริยา และทนต่อความร้อนได้ดีกว่า A406L จากการศึกษาทางจลนพลศาสตร์ของปฎิกิริยา disproportionation โดยใช้มอลโทไทรโอสเป็นซับสเทรต พบว่า เอนไซม์ A406V และ A406L มีค่า kcat/Km สูงขึ้นกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม 2.9 และ 1.4 เท่า ตามลำดับ โดยมีการเพิ่มอย่างมีนัยสำคัญของ kcat เมื่อตรวจสอบผลิตภัณฑ์ LR-CDs ของปฎิกิริยา cyclization พบว่าเอนไซม์ A406V สามารถผลิต LR-CDs ที่มีขนาดใหญ่และจำนวนที่มากขึ้นเมื่อเมื่อเทียบกับเอนไซม์ดั้งเดิม โดยเฉพาะเมื่อเพิ่มระยะเวลา และอุณหภูมิในการบ่มให้สูงขึ้น ในส่วนที่สองของงาน ได้สร้างเอนไซม์กลายเพิ่มขึ้น เพื่อปรับปรุงการทนร้อนให้ดีขึ้น โดยใช้เทคนิคการกลายยีนเฉพาะตำแหน่ง เปลี่ยนกรดอะมิโน Ala406 ให้เป็น His (H), Arg (R) และ Phe (F) และเปลี่ยนที่ตำแหน่ง Asn287 ให้เป็น Tyr (Y) เมื่อตรวจสอบลักษณะสมบัติ พบว่า เอนไซม์กลายทั้ง 4 ชนิด A406H, A406R, A406F และ N287Y เร่งปฏิกิริยา transglucosylation ลดลงอย่างเห็นได้ชัด ในขณะที่ไม่สามารถตรวจวัดแอกทิวิตีของ cyclizationได้ เอนไซม์กลายทั้ง 4 ชนิด มี optimum pH สำหรับปฏิกิริยา disproportionation เพิ่มขึ้น โดยที่ เอนไซม์กลาย N287Y เพิ่มขึ้น 0.5 pH unit ขณะที่ เอนไซม์กลาย A406H, A406R, A406F เพิ่มขึ้น 1.0 pH unit ผลที่สำคัญคือ เอนไซม์กลายทั้ง 4 ชนิด สามารถทนร้อนที่อุณหภูมิ 35 oซ, 40 oซ และ 45 oซ ได้สูงกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม เมื่อบ่มในระยะเวลา 3 ชม. และยังพบว่า เอนไซม์กลาย N287Y มี optimum temperature สำหรับปฏิกิริยา disproportionation เพิ่มขึ้น โดยเมื่อทำการตรวจสอบโครงรูปด้วยวิธี circular dichroism และรูปแบบการคงทนต่อความร้อนด้วยเทคนิค DSC พบว่า โครงสร้างทุติยภูมิของเอนไซม์กลายแทบไม่เปลี่ยนแปลง แต่โครงสร้างตติยภูมิเปลี่ยนไปเมื่อเทียบกับเอนไซม์ดั้งเดิม จากผลทั้งหมด พบว่า เอนไซม์กลายที่ทนร้อนดีที่สุด และมีแอกทิวิตีสูงกว่าเอนไซม์ดั้งเดิมคือ A406V |
| URL Website | cuir.car.chula.ac.th |
